ステロイドは免疫亢進というもう1つの顔を持つ

2020/09/16小板橋律子＝日経メディカル感染症

• ステロイド
• 抗炎症薬
• COVID-19

　今年になって猛威を振るっている新型コロナウイルス感染症（COVID-19）を引き起こす新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）。これまでにない独特の特徴を持つことから、世界中の研究者を悩ませ、臨床現場ではその対応において試行錯誤の日々が続いていた。

　でもさ、SARS-CoV-2君、人類の英知をなめてもらっては困るよ。そろそろ、我々は君にどう対応すればいいか分かってきた。ソーシャルディスタンスだの、手指衛生だのという予防対策だけでなく、診断と治療における対応法だって確立のめどが立ってきたのだよ──。そんな気分に浸ることができたのが、これまでに約250症例を経験している国立国際医療研究センター第四呼吸器内科医長の泉信有氏と、JCHO東京山手メディカルセンターの徳田均氏の2時間余りのオンライン対談だった。

対談◎コロナ肺炎の実像に迫る【その1～3】
◆コロナ肺炎の改善or悪化はCT像で予想できる
◆「コロナ肺炎が急変して挿管」は回避できる
◆コロナ肺炎治療のカギは抗炎症薬

　終始控えめで臨床家として慎重な姿勢を崩さない泉氏だったが、これまでの経験から、COVID-19は治療可能な疾患であり、死亡率はまだまだ下げられるとの自信が、その言葉の隅々ににじんでいた。

　現在、COVID-19の治療薬として国内で承認され、投与が推奨されているのは抗ウイルス薬のレムデシビルとステロイド系抗炎症薬のデキサメタゾンの2剤。特に泉氏が期待するのがデキサメタゾンだ。「抗炎症薬だけで治癒した症例が出てきているのが現状で、ステロイド（ステロイド系抗炎症薬）を軸とした抗炎症治療を積極的に実施している」と説明する。

　対談相手の徳田氏も、「COVID-19の重症化にはサイトカインストームが強く関わっているといわれているので、炎症を抑える治療が重要になるだろう」と呼応。COVID-19では、ウイルス感染が引き金ではあるが、それに引き続き宿主側の免疫応答が過剰になることが問題であるのだから、その過剰な免疫反応を抑制する必要があるという。

ステロイドはリンパ球だけでなくマクロファージや線維芽細胞も抑制

　ここで、なぜステロイド系抗炎症薬がCOVID-19に効果があるのか考えてみたい。ステロイドの働きに詳しい京都大学ウイルス・再生医科学研究所免疫制御分野教授の生田宏一氏は、「ステロイド系抗炎症薬にはリンパ球に加えて、マクロファージや線維芽細胞などの働きも抑える効果がある」と説明する。「マクロファージや線維芽細胞は炎症性サイトカインを分泌するが、その産生細胞を抑制できればサイトカインストームの根元を抑えられるだろう」とも考察する。

　その一方で、ステロイド系抗炎症薬はリンパ球の働きをも抑えるため、抗体産生や感染細胞の排除が不十分となり、感染症が悪化する危険性がある。

　実際、世界保健機関（WHO）は、同じコロナウイルスである重症急性呼吸器症候群（SARS）、中東呼吸器症候群（MERS）における投与で有害事象を生じたとの報告があったことから、当初、ステロイド系抗炎症薬の使用には消極的で、臨床研究に限って使用するよう求めていた（SARS、MERSとCOVID-19でステロイド系抗炎症薬への反応性が異なるのはなぜかについては、別の記事で紹介予定）。その方針を180度転換したのが、9月2日。ステロイド系抗炎症薬によるCOVID-19の死亡率減少効果がメタアナリシスで確認されたのがきっかけだった（関連記事：WHOが重症新型コロナへのステロイドを推奨）。

ステロイドには免疫を増強する作用もある

　様々な疾患の治療に用いられるステロイド系抗炎症薬だが、もともとは生体内に存在するグルココルチコイド（糖質コルチコイド）に由来する。

　グルココルチコイドの生体内での働きについて生田氏は「血糖上昇効果など様々な機能が知られているがそれは全て生体防御機能に関連する。また、その分泌はストレス負荷で促進されることから、グルココルチコイドは生体防御ホルモンと考えられている」と説明する。

　ただし、免疫機能の抑制効果は生体防御とは相反する機能だ。その矛盾に疑問を感じた生田氏らが、「生体内のグルココルチコイドは免疫力を高めている」ことを明らかにした（https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.01.004）のは、2018年のこと。グルココルチコイドはTリンパ球の体内循環と免疫応答能の日内変動を制御し、生体の免疫力を高めていることを見出した。実際、感染が生じると体内のグルココルチコイド濃度は上昇し、免疫応答を生じているともいう。

　すなわち、治療薬として投与する高用量ステロイド系抗炎症薬は免疫を抑制するが、その数分の1程度の低用量グルココルチコイドには免疫を高める効果がある。ステロイドには濃度次第で真逆な作用を生じる2つの顔があるのだ。

　生田氏は、「現段階では根拠のない妄想だが、もしかしたらステロイドは病原体が侵入してきた際の免疫応答を惹起するが、その分泌がある程度まで高まると、逆に免疫機能を抑えるブレーキとして働くフィードバック機構を有するのかもしれない」と語る。

　1950年のノーベル生理学・医学賞は、グルココルチコイドなどの副腎皮質ホルモンの発見と構造、生理学的作用の発見に授与された。その発見を基にステロイド系抗炎症薬が実用化され、様々な疾患を患う多くの患者を救ってきた。しかし、グルココルチコイドの本来の機能かもしれない、免疫増強作用が明らかになったのはほんの数年前でしかない。さらにグルココルチコイドには体内時計の調整作用があるなどの新たな知見も明らかになっている。

　コロナ禍を巻き起こし、全世界を混乱させたCOVID-19にステロイド系抗炎症薬が有効であるというエビデンス。このエビデンスはそれだけで多くの患者を救うことになるだろう。さらに、「なぜ有効なのか？」という問いを突き詰めれば、COVID-19のような感染症だけでなく、自己免疫疾患など免疫が関連する様々な疾患の知られざる病態の解明にもつながりそうだ。そんなポテンシャルを生田氏の話を聞きながら感じた。

　いつまでもCOVID-19に翻弄されてなるものか、今回の世界的流行を逆手に取って医学のさらなる進歩をつかみ取ろうではないか！

糖質コルチコイドは、インターロイキン-7受容体とCXCR4を誘導することにより、T細胞の分布と応答の日周振動を促進します

ハイライト

• ••糖質コルチコイドは、T細胞におけるIL-7R発現の日周振動を促進します
• ••リズミカルなIL-7R発現は、CXCR4発現を介してT細胞の再分布を誘導します
• ••リンパ器官におけるT細胞の日中の蓄積は適応免疫応答を強化します

概要

糖質コルチコイドは、強力な抗炎症作用と免疫抑制作用を持つステロイドホルモンであり、日中の方法で生成されます。糖質コルチコイドはT細胞でインターロイキン-7受容体（IL-7R）の発現を誘導する可能性がありますが、生理学的濃度でT細胞の恒常性と応答を制御するかどうかは不明です。糖質コルチコイド受容体シグナル伝達は、IL-7Rα遺伝子座のエンハンサーに結合することにより、マウスT細胞でIL-7Rの発現を誘導し、真夜中にピークがあり、正午に谷があることがわかりました。このIL-7Rの日中の誘導は、ケモカイン受容体CXCR4の発現を制御することにより、T細胞の生存と、リンパ節、脾臓、および血液間の再分布をサポートしました。マウスでは、夜間の脾臓におけるT細胞の蓄積により、可溶性抗原および全身性細菌感染に対する免疫応答が増強されました。

グラフィカルな抽象

キーワード

• 糖質コルチコイド
• インターロイキン-7
• 日周リズム
• T細胞
• CXCR4

前書き

糖質コルチコイドは、グルコース代謝、認知、ストレス耐性などの多様な生物学的プロセスに寄与するステロイドホルモンのグループです。それらはまた強力な抗炎症および免疫抑制効果を持ち、臨床診療で広く使用されています。糖質コルチコイドは、副腎皮質刺激ホルモンに反応して副腎皮質によって日中の方法で産生されます。人間の場合、血中糖質コルチコイドのレベルは朝にピークに達し、日中と夜の最初の部分で低下します。マウスなどの夜行性の動物では、この概日変動は逆転します。糖質コルチコイドは、細胞質内の糖質コルチコイド受容体（GR）に結合することによってその機能を発揮します。次に、GRは核に伝達され、そこで標的遺伝子の糖質コルチコイド応答要素（GRE）に結合することによって転写因子として機能します。Ashwell et al。、2000）。糖質コルチコイドは、CD4 ⁺ CD8 ⁺未成熟胸腺細胞のアポトーシスを誘導します（Screpanti et al。、1989）。それにもかかわらず、T細胞の発達はGR欠損マウス（Nr3c1 ^{– / –}）では損なわれていません（Purton et al。、2000）。したがって、免疫系における糖質コルチコイドの生理学的機能は不明なままです。糖質コルチコイドは免疫系と直接関連しています。例えば、それらはT細胞においてIL-7受容体α鎖（IL-7Rα）の発現を誘導します（Franchimont et al。、2002）。IL-7、免疫系の発達と維持に重要なサイトカイン（Mazzucchelli and Durum、2007年）、一般的なγ鎖サイトカインファミリーのメンバーです。IL-7Rシグナル伝達は、転写因子シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子（STAT）5とホスファチジルイノシトール3-キナーゼを活性化することにより、T細胞の増殖、生存、および分化を促進します。以前、GRがIL-7Rα遺伝子座のエンハンサーのGREに結合し、その転写を活性化することを報告しました（Lee et al。、2005）。実際、IL-7Rαエンハンサーの標的欠失は、IL-7Rの発現を低下させ、末梢T細胞の生存と応答を損ないます（阿部ほか、2015年）。さらに、IL-7Rαエンハンサー欠損マウスは、T細胞における糖質コルチコイドによるIL-7R誘導を完全に欠いています。これらの結果は、糖質コルチコイドがIL-7Rの発現を誘導することによりT細胞の恒常性を促進する可能性があることを示唆しています。概日リズムは免疫系にかなりの影響を及ぼします。アドレナリン作動性神経信号は、リンパ節における日中のリンパ球再循環を介して適応免疫応答を調節します（鈴木ほか、2016年）。より直接的には、リンパ球時計遺伝子Arntlは、ケモカイン受容体CCR7およびスフィンゴシン-1-リン酸受容体1（S1PR1）の発現を調節することにより、リンパ節を介した輸送と免疫応答を制御します（Druzd et al。、2017）。それらの日中の産生のために、糖質コルチコイドは重要な概日メディエーターです。たとえば、糖質コルチコイドは、Per2やNfil3などの内因性時計遺伝子の発現を調節し、体内全体の概日変化を促進します（So et al。、2009）。さらに、糖質コルチコイドは、炎症性条件下および好中球動員下での肺上皮細胞におけるケモカインCXCL5発現の概日変化を制御します（Gibbs et al。、2014）、糖質コルチコイドが自然免疫および獲得免疫反応において役割を果たすことを意味します。糖質コルチコイドがIL-7R発現を調節することにより、T細胞の恒常性を調節し、日周期で機能するかどうかを調べるために、IL-7RαエンハンサーGRE変異体とT細胞特異的GR欠損マウス（Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺）を分析しました。IL-7Rは、概日リズムでGRによって誘導され、CXCR4の発現を介して、T細胞の生存とリンパ節、脾臓、パイエル板への動員をサポートすることがわかりました。さらに、T細胞分布の日変化は、マウスの夜間の免疫反応を増強しました。まとめると、我々の結果は、適応免疫が糖質コルチコイドによる日中の制御下にあり、内分泌系と免疫系の間の新しいリンクを明らかにしていることを示しています。

結果

 GRはリンパ器官におけるIL-7R発現とT細胞数の日内変化を調節します

グルココルチコイドは、T細胞恒常性および活性を調節するかどうかを決定するために、in vivoで、我々は、T細胞特異的のGR欠損（中IL-7Rの発現を調べNr3c1 ^{FL / FL} CD4 -cre ⁺）マウス（図S1 A）。IL-7Rの発現は、IL-7R式（減少を示した胸腺調節T（Treg細胞）細胞を除いて、ほとんどの胸腺細胞において変化しなかった図S1 BとS1C）が、正常な発達を施行（図S1 D-S1Hを）。末梢では、IL-7Rの発現はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺ T細胞で減少しました（図1A）。さらに、IL-7Rの低下は夜間にのみ観察されました（図1B）。IL-7Rの発現は日周期で変化し、Zeitgeber時間（ZT、24時間の明/暗サイクルでライトオンを時間0として定義）16（夜の時点）にピークがあり、コントロールではZT4（昼の時点）に最下点があります。マウスですが、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスでは1日を通して変化しませんでした（図1C）。この変化は、糖質コルチコイドレベルの日内変動に続く可能性があります（Gibbs et al。、2014）。IL-7R発現の日内変動はmRNAレベルで調節され、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスでは失われ（図1 D）、GRが末梢T細胞におけるIL-7R発現の日内リズムを調節することを示しています。これらの結果は、GRがT細胞機能の日内変化を制御している可能性があることを示唆しています。

この可能性を探るために、日中の末梢リンパ器官のT細胞数を分析しました。循環リンパ球数は、ヒト末梢血で変動し、夜間に上昇し、日中に低下します（ハウスとスモレンスキー、1999年）。対照マウスの血液では、CD4 ⁺ T、CD8 ⁺ T、およびTreg細胞の絶対数が変動し、ZT4にピークがあり、ZT16に最下点がありました（図1E）。対照的に、血中のT細胞数はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスの方が対照よりも少なく、昼と夜の差は失われました。血液中のT細胞数の日変化により、T細胞は日中にリンパ組織と血液の間を再循環すると仮定しました。確かに、リンパ節のT細胞数は、ZT12にピークがあり、ZT0に最下点がある日内変動を示し、この変動はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスでは失われました（図1F）、以前のレポートと一致（Druzd et al。、2017）。対照マウスの脾臓およびパイエル板では、T細胞数は血液と反対の変化を示し、ZT16にピークがあり、ZT4に最下点があり、この変動はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスで失われました（図1 Gおよび1H）。これらの結果は、GRがリンパ器官と末梢血の間のT細胞分布を制御していることを示唆しています。

 GRは、IL-7RエンハンサーでGRモチーフに結合することによってIL-7Rアップレギュレーションを調節インビボ

以前、GRがIL-7Rα遺伝子座のエンハンサー、保存された非コード配列（CNS）-1を介してIL-7R発現を調節することを示しました（阿部ほか、2015年）。GR直接IL-7Rの発現を調節するかどうかを決定するために、in vivoで、我々は、一つまたはIL-7Rαエンハンサー（内の2つのグルココルチコイド応答エレメント（GRE）の両方において点突然変異を保有するマウスを生成し、図S2 A-S2C）を。IL-7Rの発現は、IL-7R-CNS1-GRE変異マウスの胸腺Tregおよび末梢T細胞で減少しましたが、他の胸腺細胞サブセットでは減少しませんでした（図2 A、S2 D–S2F、およびS3 A–S3D）。Il7r ^{CNS1.GRE1m / 1 m}（GRE1m）およびIl7r ^{CNS1.GRE2m / 2 m}（GRE2m）マウスでは、単一モチーフに変異があり、Il7r mRNAおよび細胞表面IL-7Rのレベルが低下しましたが、Il7r ^{CNS1.GRE12m / 12 m}（GRE12m）両方のモチーフに変異があるマウスは、より深刻な減少を示しました。次に、フローサイトメトリーを実行して、日中のT細胞でのIL-7R発現の変化をさらに確認しました。IL-7Rの発現は日周期で変化し、対照マウスではZT16にピークがあり、ZT4に最下点がありましたが、GRE12mマウスでは1日を通して変化しませんでした（図2B）。IL-7RαmRNAのレベルも同様の日変化を示しました（図2C）。次に、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイを実行して、GRが日中の方法でCNS-1に結合するかどうかを調べました。WTマウスのT細胞では夜間にのみ特異的GR結合が観察されましたが、GRE12mマウスのT細胞ではこの結合が完全に失われました（図2D）。

次に、invivoでGRが誘導するIL-7Rの機能を解明しようとした。GRE12mマウスの表現型は、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスの表現型と類似していた、すなわち、リンパ組織と末梢血の間のT細胞の日中の再分布を欠いていた（図2 E–2H）。IL-7RがT細胞の日周再分布を制御するかどうかを判断するために、T細胞特異的IL-7R欠損（Il7r ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺）マウスを分析しました。これらのマウスは対照マウスと比較してT細胞数の深刻な減少を示しましたが、T細胞の日中の再分布は失われました（図S3E–S3G）。これらの発見は、GRがIL-7RαエンハンサーのGREに直接結合することによってIL-7R発現をアップレギュレートすることを示す以前の研究を確認しました。さらに、これらの結果は、GRによって誘導されるIL-7Rの発現が、リンパ組織と末梢血の間のT細胞分布の日内変化を調節することを示唆しています。

 GRはIL-7RおよびBcl2の発現を介してT細胞の生存を調節します

IL-7Rの減少がT細胞の生存に影響を与えるかどうかを評価するために、まずナイーブT細胞をIL-7とともに6日間培養しました。IL-7は、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺およびGRE12mマウスで、コントロールマウスよりも少ないT細胞をレスキューしました（図S4 AおよびS4B）。T細胞の生存がinvivoで損なわれたかどうかを判断するために、CD45.1 ⁺（コントロール）およびCD45.2 ⁺（Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺またはGRE12m）ナイーブCD4 T細胞をCFSEで標識し、混合して移しました。 CD45.2 ^+にC57BL / 6マウス。8日後、コントロールマウスとGRE12mマウスの間で、脾臓、リンパ節、末梢血のT細胞の頻度を比較しました。GRE12m T細胞は、コントロールT細胞よりも豊富ではありませんでした（図S4 CおよびS4D）。さらに、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺ T細胞の表現型は、GRE12mT細胞の表現型よりも重症でした。次に、T細胞が日中に高い割合で死ぬかどうかを判断するために、細胞死の指標である活性化カスパーゼ3のレベルを新たに単離したナイーブCD4 ⁺ T細胞で比較しました。対照マウスのCD4 ⁺ T細胞は、夜間よりも昼間に高レベルの活性化カスパーゼ3を含んでいました（図S4E）。次に、抗アポトーシス因子Bcl2およびBclxLの発現を分析しました。Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスは、末梢T細胞および胸腺細胞でBcl2およびBclxLのレベルの低下を発現しましたが（図S4 F–S4H）、GRE12mマウスは発現しませんでした（図S4 I–S4K）。これらの結果は、GRがIL-7R依存性経路と非依存性経路の両方によってT細胞の生存をサポートしていることを示唆しています。さらに、データは、T細胞の生存障害がGRE12mマウスのT細胞振動の障害に何らかの役割を果たす可能性があることを示唆しています。さらに、Bcl2およびBclxLの発現は、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスの胸腺細胞で減少しましたが、それらの細胞数は変化しませんでした（図S1D–S1H）。

 GRとIL-7Rは、CXCR4発現を誘導することによりT細胞分布の日変化を調節します

次に、T細胞の日中の再分布を制御するメカニズムを解明しようとしました。CXCR4が糖質コルチコイドとIL-7によって誘導されるという以前の報告に照らして（ディミトロフ他、2009年、 Jourdan et al。、2000）、ナイーブT細胞での2つのケモカイン受容体CXCR4とCCR7の発現をモニターしました。CCR7の発現は、コントロールマウスと比較してNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスでは変化しませんでした（図S5A ）。コントロールマウスのCD4 ⁺およびCD8 ⁺ T細胞では、CXCR4タンパク質およびmRNAのレベルが夜間に高く、日中に低くなりました（図3 A–3F）。対照的に、CXCR4 mRNAの夜間レベルは、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺およびGRE12mマウスで減少し、CXCR4発現の日内変動はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4-cre ^+で失われました。およびGRE12mマウス。CXCR4発現の日変化がT細胞の遊走に影響を与えるかどうかを判断するために、ケモカインCXCL12を使用してトランスウェル遊走アッセイを実施しました。対照マウスでは、夜間に分離されたT細胞は日中に分離されたものよりも効率的に移動しましたが（図3 Gおよび3H）、この違いはNr3c1 ^{fl / fl} Cd4-cre ⁺およびGRE12mマウスではなくなりました。これらの結果は、CXCR4のアップレギュレーションが夜間にT細胞の脾臓へのホーミングを引き起こす可能性があることを示唆しています。

脾臓へのT細胞ホーミングが変異マウスで損なわれているかどうかを判断するために、CD45.1 ⁺（コントロール）とCD45.2 ⁺（Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺またはGRE12m）CD4 ⁺ T細胞を混合し、CFSEで標識しました。昼間または夜間にレシピエントマウスに移しました。T細胞が夜間に移入されると、脾臓の変異T細胞の頻度は対照T細胞と比較して減少しましたが、末梢血の頻度は上昇しました（図3Iおよび3J）。細胞が日中に移されたとき、この効果は観察されませんでした。次に、CXCR4がT細胞の再分布を制御するかどうかを評価するために、T細胞特異的なCXCR4欠損（Cxcr4 ^{fl / fl}）を分析しました。Cd4 -cre ⁺）マウス。対照マウスとは異なり、Cxcr4 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスは、血液、リンパ節、および脾臓のT細胞数の日内変化を欠いていました（図3 K–3M）。血中のT細胞数は、Cxcr4 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスでより高いレベルに保たれており、ホーミングの障害だけでは細胞の生存率が低下しないことを示唆しています。それ以外の場合、CD127およびBcl2の発現またはin vivoでの生存に関して、コントロールとCxcr4 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺ T細胞の間に違いはありませんでした（図S5B–S5D）。これらの結果は、GRによって誘導されるIL-7RがCXCR4の発現を日内に調節し、CXCR4がリンパ器官と血液の間のT細胞分布の日変化に重要であることを示しています。次に、インビボでの糖質コルチコイドの投与が、T細胞におけるIL-7RおよびCXCR4の発現および脾臓におけるそれらの蓄積を誘導するかどうかを試験した。IL-7Rの発現は、ZT4でのデキサメタゾン注射の4時間後にCD4 ⁺ T細胞で上昇しました（図S5E ）。同時に、CXCR4はCD4 ⁺ T細胞で誘導されました。CD4 ⁺ T細胞の数も脾臓で上昇しました。これらの結果は、外因性糖質コルチコイドがIL-7RおよびCXCR4発現の誘導と、脾臓と血液の間のT細胞の再分布を再現することを示しています。対照的に、IL-7の単独投与は、invivoでもinvitroでも、CD4 ^+のCXCR4発現を変化させませんでした。T細胞（図S5 FおよびS5G）は、CXCR4の発現にIL-7が必要であるが、十分ではないことを示唆しています。

 GRはCXCL12産生細胞へのT細胞ホーミングを調節します

CXCR4はT細胞遊走の日周期に重要であり、その発現はIL-7シグナル伝達に依存するため、次に、GRが脾臓およびパイエル板のCXCL12およびIL-7産生細胞の近くでT細胞遊走を制御するかどうかを調べました。脾臓では、CXCL12は赤脾髄およびT細胞ゾーンとB細胞ゾーンの血管のサブセットで強く発現しています（図4Aおよび4B）。予想通り、ドナーT細胞は、CXCL12発現領域、赤脾髄、および血管の周囲に蓄積しました。一方、IL-7発現細胞はT細胞ゾーンと血管の周囲に散在していた（図4Cおよび4D）。T細胞は、T細胞ゾーンとB細胞ゾーンでIL-7発現細胞に囲まれた血管の周囲に局在しているように見えました。T細胞のホーミングが損なわれているかどうかを決定するためにNr3c1 ^{FL / FL} CD4-cre ⁺マウス、コントロールおよびNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスのT細胞を異なる色素で標識し、1：1で混合し、Cxcl12 -GFPマウスに移しました。コントロールマウスのT細胞は、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスのT細胞よりも、CXCL12 ⁺細胞の近くに頻繁に局在していました（図4Eおよび4F）。パイエル板では、T細胞ゾーン内およびその周辺でGFPシグナルが検出されました（図S6AおよびS6B）。コントロールマウスのT細胞はCXCL12 ^+の近くに局在する傾向がありましたT細胞ゾーン周辺の細胞。脾臓は対照的に、パイエル板における血管は、IL-7発現細胞に囲まれていたが、CXCL12によるもの⁺細胞（図S6からBおよびS6C）、およびT細胞Nr3c1 ^{FL / FL} CD4 -cre ⁺マウスはパイアーに少ない移行しましたパッチ（図S6 DおよびS6E）。これらの結果は、GRによって誘導されるCXCR4発現が、脾臓のCXCL12産生細胞へのT細胞ホーミングを調節することを示しています。

 GRは日中の方法でIL-2応答とT細胞活性化を強化します

T細胞のプライミングはリンパ組織で起こるため、夜間のT細胞の蓄積が脾臓とパイエル板で効率的なT細胞の活性化を誘導する可能性があると仮定しました。糖質コルチコイドとIL-7はIL-2受容体α鎖（CD25）の発現をアップレギュレートするため（Franchimont et al。、2002）、最初に抗CD3および抗CD28抗体で刺激した後のT細胞活性化を分析しました。Nr3c1 ^{FL / FL} CD4 -cre ⁺ CD4 ⁺およびCD8 ⁺ T GRE12m T細胞は（しなかったZT4及びZT16で単離された細胞は、増殖障害を示し、図5 A及びS7 A）。一貫して、Nr3c1 ^{FL / FL} CD4 -cre ⁺ GRE12m T細胞は（しなかったT細胞は、CD25発現およびSTAT5のリン酸化の減少を示した図5 B、5C、およびS7 B）。一方、IL-2受容体β鎖（CD122）の発現はNr3c1 ^{fl / fl}でわずかに上昇しましたCd4 -cre ⁺ T細胞。これらの結果は、IL-7Rの発現とは無関係に、GRシグナルがT細胞受容体（TCR）刺激後のT細胞の増殖を制御していることを示唆しています。次に、コントロールとNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスに、オボアルブミン（OVA）を発現するリステリア菌を感染させ、OVA特異的CD8 ⁺ T細胞を分析しました。対照マウスでは、OVA特異的CD8 ⁺ T細胞の割合と細胞数は、マウスが感染し、夜間に分析された場合、日中に操作が行われた場合よりも高かった（図5Dおよび5E）。対照的に、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre⁺マウスでは、OVA特異的CD8 ⁺ T細胞の数が減少し、日内変化はそれほど顕著ではありませんでした。さらに、GRE12mマウスは、TCR刺激後のT細胞増殖が損なわれていなくても、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスと同様の表現型を示しました（図5Fおよび5G）。これらの結果は、糖質コルチコイドが、絶対細胞数を増加させることに加えて、夜間に細胞ごとにCD8 ⁺ T細胞の応答性を高めることを示しています。

 GRはTh細胞サブセットの分化とB細胞の免疫応答を制御します

糖質コルチコイドは1型ヘルパーT（Th1）とTh2細胞のバランスに影響を与えるため（エレンコフ、2004年）、次に、ナイーブCD4 ⁺ T細胞のTh1細胞とTh2細胞への分化を分析しました。インターフェロン（IFN）-γ産生細胞の分化はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺ T細胞で上昇しましたが、IL-4-およびIL-13産生細胞の分化は低下しました（図S7CおよびS7D）。転写因子E4BP4は糖質コルチコイドによって誘導されます（So et al。、2009）そしてTh2サイ​​トカイン産生を調節します（柏田ほか、2011年、 本村ほか、2011年）。これと一致して、GATA結合タンパク質3（GATA3）ではなくE4BP4の発現が、Th2細胞誘導条件下で培養されたNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺ T細胞で減少しました（図S7E ）。次に、コントロールとNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスをZT16のOVAで免疫しました。7日後、脾臓細胞をOVAで3日間刺激した。IL-4およびIL-13の産生は、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスで有意に損なわれ、IL-4およびIL-13 mRNAのレベルもNr3c1fl ^{/ flの}濾胞ヘルパーT（Tfh）細胞で減少しました。Cd4 -cre ⁺マウス（図S7 FおよびS7G）。対照的に、GRE12mマウスはTh細胞分化に変化を示さなかった（図S7H ）。これらの結果は、GRがIL-7Rの発現とは無関係にTh細胞の分化を制御していることを示唆しています。次に、B細胞の免疫応答が糖質コルチコイドの影響を受ける概日リズムにも従うかどうかを評価するために、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスを夜間または昼間にOVAで免疫しました。エフェクターCD8 ⁺ T細胞と同様に、この免疫化により、対照マウスではTfh細胞、胚中心B細胞、免疫グロブリン（Ig）G1 ⁺ B細胞が日周リズム（夜間は高く、昼間は低い）で誘導されましたが、この日周変化はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスでは障害がありました（図6 A–6C）。さらに、NP特異的IgG1およびIgG2bの産生は、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 – creで減少しました。⁺夜のマウス、および日周リズムが失われました（図6D）。Tfh細胞、胚中心B細胞、およびIgG1 ⁺ B細胞の日中の誘導は、GRE12mマウスで減少しました（図S7I ）。これらの結果は、GRがIL-7Rの発現に応じて、Tfh細胞を介して日中の方法でB細胞の免疫応答を制御することを示しています。

パイエル板はリンパ組織であり、免疫がなくても胚中心が共生微生物によって誘導されます（原田ほか、2012年）。対照マウスのパイエル板では、Tfh細胞、胚中心B細胞、およびIgG1 ⁺ B細胞の数は昼間と夜間で変化せず、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスではそれらの数が減少しました（図6 Eおよび6F）。 ）、一方、GRE12mマウスのものはそれほど明確な減少を示さなかった（図S7J ）。これらの結果は、GRがIL-7Rの発現とは無関係に、T細胞を介したB細胞応答に寛容な影響を与える可能性があることを示唆しています。

 GRはIL-7R発現を調節することによりメモリーCD4 ⁺ T細胞の維持をサポートします

IL-7RはメモリーT細胞でより高いレベルで発現され、それらの生存に重要であるため（Kondrack et al。、2003、 Schluns et al。、2000）、次に、糖質コルチコイドがメモリーCD4 ⁺ T細胞におけるIL-7R発現を調節するかどうかをテストしました。Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスではTh2細胞の機能が損なわれているため、養子移入モデルを使用してメモリーTh2細胞を生成しました（遠藤ほか、2011年）。まず、ナイーブT細胞をTh2細胞条件下で6日間培養した後、エフェクターT細胞をB6.CD45.1 ⁺マウスに移しました。4週間後、脾臓のCD45.2 ⁺メモリーT細胞におけるIL-7R発現を分析しました。ナイーブT細胞と同様に、IL-7R発現は、コントロール細胞と比較して、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺およびGRE12mメモリーT細胞で減少しました（図7Aおよび7B）。さらに、IL-7R発現の日内変化は変異体メモリーT細胞で失われました（図7C）。数Nr3c1 ^{FL / FL} CD4 -cre ⁺とGRE12mメモリーT細胞は脾臓、リンパ節、及び肺において減少しました。Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺細胞は、GRE12m細胞よりも大幅に減少しました（図7D）。ナイーブT細胞と同様に、Bcl-2の発現はNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺細胞では減少しましたが、GRE12m細胞では減少しませんでした（図7E）。これらの結果は、GRによるIL-7R誘導がメモリーT細胞の維持に重要であることを示しています。

討論

糖質コルチコイドには強力な抗炎症作用と免疫抑制作用があるという長年の見解とは対照的に、この研究は糖質コルチコイドが免疫増強作用を持っていることを明らかにしました。糖質コルチコイドとGRは、IL-7Rαエンハンサーに結合することにより、T細胞で日中の方法でIL-7Rの発現を直接誘導することを発見しました。上昇したIL-7Rは、CXCR4の発現を介して末梢リンパ器官へのT細胞のホーミングを誘導し、マウスの夜間のT細胞とB細胞の免疫応答を増強します。GRE12mマウスの使用は、この理解に導く上で非常に重要でした。糖質コルチコイドによるT細胞の日中の再分布は、広範囲のT細胞クローンの再循環と長期生存を促進する可能性があります。糖質コルチコイドはヒトT細胞でもIL-7Rの発現を誘導するためです（Franchimont et al。、2002）、糖質コルチコイドのこの免疫増強機能は、ヒトでも機能する可能性があります。我々の発見は、糖質コルチコイドとIL-7がT細胞の生存に重要であることを示唆しているが、細胞の生存がT細胞の日中の再分布に寄与するかどうか、またはどのように寄与するかは完全には理解されていない。Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺およびGRE12mマウスでは、T細胞の生存が損なわれているため、変異マウスのT細胞数の振動の障害に何らかの役割がある可能性があります。ただし、Cxcr4 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスは、生存に欠陥がなく、T細胞の日中の再分布の実質的な障害を示します。これは、ホーミングの障害だけでは、必ずしも血中の細胞数が減少するわけではないことを示唆しています。したがって、CXCR4の発現は、細胞の生存よりも日中の再分布においてより重要な役割を果たしているようです。私たちの調査結果は、免疫系の概日変化に関して重要な意味を持っています。血中糖質コルチコイドレベルは、怪我や感染のリスクが高まる日常生活の活動期に上昇します。結果として生じる脾臓へのT細胞の蓄積は、侵入する微生物と戦うのに役立ちます。これと一致して、免疫系は日周リズムの制御下にあります。以前の研究では、自然免疫細胞が夜間の細菌感染に効率的に反応することが示されていました（Curtis et al。、2014）。概日CXCL12の発現は、老化した好中球の骨髄への移動と、組織に存在するマクロファージによるそれらの飲み込みを誘発します（カサノバ-エースベス他、2013年）、およびマクロファージの肝臓X受容体は、食作用関連遺伝子の概日発現を調節します。さらに、Toll様受容体（TLR）9の発現は、マクロファージおよびB細胞の夕暮れ時に高くなります（シルバー他、2012年）。さらに、炎症性サイトカインとB7共刺激分子のレベルは、脾臓では昼間よりも夜間の方が高くなっています（シルバー他、2012年）、抗原提示が夜間に増強される可能性があることを示唆している。リンパ節T細胞のinvitro増殖は、主にシグナル伝達分子ZAP-70の発現が高いため、細胞が日中よりも夜間に単離された場合に速くなりますが、T細胞応答は、マウスが日中に免疫された場合よりも強くなります夜 （Fortier et al。、2011）。これらの時点のいくつかは、脾臓へのT細胞再分布の糖質コルチコイド誘発性日周リズムに対応します。免疫系の概日変化は、少なくとも3つのメカニズムによって制御されます。第一に、アドレナリン作動性神経信号は、リンパ節における日中のリンパ球再循環によって適応免疫応答を調節します（鈴木ほか、2016年）。第二に、リンパ球時計遺伝子Arntlは、CCR7とS1PR1の発現を調節することにより、リンパ節を通過する輸送と免疫応答を制御します（Druzd et al。、2017）。これらの2つの経路は、主に末梢リンパ節を介したリンパ球の再循環を調節する役割を果たします。第三に、糖質コルチコイドは、血液とリンパ器官の間のT細胞の日中の再分布を調節し、脾臓の免疫反応を高めます。一緒に、これらのメカニズムは、リンパ節と脾臓の間のT細胞数の振動に時間的な違いを生み出す可能性があります。より詳細な分析は、リンパ器官におけるリンパ球分布の日変化のより包括的なビューを明らかにするのに役立ちます。糖質コルチコイドは、IL-7R依存性および非依存性のメカニズムによってT細胞機能を制御します。我々は、CXCR4を介した日中のT細胞の再分布がNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺およびGRE12mマウスで同様に調節されることを示し、このプロセスが主にIL-7R依存性メカニズムに依存することを示唆しました。対照的に、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスは、ナイーブT細胞とメモリーT細胞の生存、およびCD8 ^+の免疫応答に関して、より深刻な表現型を示しました。GRE12mマウスよりもT細胞。糖質コルチコイドは、おそらくIL-7R依存性と非依存性の両方のメカニズムによってこれらの免疫機能を調節します。最後に、Th細胞サブセットの分化とB細胞免疫応答は、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺およびGRE12mマウスで損なわれ、グルココルチコイドが主にIL-7R依存性メカニズムを介してこれらのプロセスを調節することを示唆しています。GRは、Nfil3などの他の標的遺伝子を活性化することによって、または他の転写因子と直接相互作用することによって、IL-7Rに依存しない機能を発揮する可能性があります。GRは、複数のメカニズムでTh細胞サブセットの分化と応答を制御します。我々の発見は、GRがTh2サイ​​トカイン産生とB細胞免疫応答を増強するのに対し、GRはTh1細胞の分化を抑制することを明らかにした。糖質コルチコイドは、AP-1、NF-κB、NFATなどの転写因子を抑制することによってTh1細胞の分化を阻害します（Ashwell et al。、2000）また、STAT4およびTボックス転写因子21（TBX21）シグナルを抑制します（Franchimont et al。、2000、 Liberman et al。、2007）。さらに、我々の結果は、E4BP4の発現がNr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺マウスで損なわれていることを示しています。E4BP4はIL-4およびIL-13産生の調節に重要です（柏田ほか、2011年）、およびGRはそのプロモーターに結合することによってNfil3遺伝子の転写を誘導します（So et al。、2009）。したがって、我々の発見は、GRがE4BP4を誘導することによってIL-4およびIL-13の産生を増強する可能性があることを示唆している。のでNFIL3は、時計遺伝子そのものであり、その発現は夜間高く、GR-E4BP4軸は、Th2細胞の免疫応答の日変化のために重要であるかもしれません。さらに、GRが日中のIL-7R誘導を介して記憶Th2細胞の生存をサポートすることを示しています。IL-7シグナルはTh2サイ​​トカインの産生を助けるため（Guo et al。、2015）、GRはTh2細胞の免疫応答を高める可能性があります。糖質コルチコイド、ミネラルコルチコイド、アンドロゲン、エストロゲンなどのステロイドホルモンは、免疫系に強い影響を与える可能性があります。糖質コルチコイドだけでなく、アンドロゲンやエストロゲンも副腎皮質から日中の方法で生成されます。この研究では、糖質コルチコイドがIL-7Rの発現とリンパ器官へのT細胞の再分布を誘導することにより、T細胞とB細胞の応答を増強することを実証しました。さらに、私たちの研究は、糖質コルチコイドがTh1細胞の分化を防ぎ、Th2細胞の分化を増強することを示唆しています。糖質コルチコイドに加えて、アンドロゲンはTh1細胞の分化を阻害しますが、エストロゲンはIFN-γとIL-10の産生を促進します（Gilmore et al。、1997、 Kissick et al。、2014、 宮浦・岩田、2002）。さらに、これらの影響は概日周期の制御下にある可能性があり、これは次に、喘息および関節リウマチの症状が朝に悪化する傾向があるという観察に関連している可能性があります。したがって、免疫の多くの側面がステロイドホルモンの制御下にある可能性があります。将来の研究では、ステロイドホルモンの観点から免疫学的現象を解決することを目指す必要があります。糖質コルチコイドは、さまざまなメカニズムによって粘膜免疫を制御する可能性があります。GR-IL-7R軸がパイエル板への日中のT細胞ホーミングを誘導し、糖質コルチコイドがパイエル板のTfh細胞分化とB細胞応答を増強することを明らかにしました。これらの観察は、粘膜免疫における糖質コルチコイドの新しい役割を示唆している。粘膜免疫系は、食物消化や共生細菌の活動などの概日振動の影響を受けます（フセインとパン、2009年）。これは次にTLRの活性化と炎症性サイトカインの産生を引き起こし、糖質コルチコイドによるT細胞の蓄積とともに、粘膜免疫系が侵入した細菌を取り除くのを助けます。さらに、腸上皮細胞は概日リズムで糖質コルチコイドを産生します（Cima et al。、2004、 フセインとパン、2009年、 Mukherji et al。、2013）、腸の糖質コルチコイドも粘膜免疫を強化する可能性があることを示唆しています。粘膜免疫における糖質コルチコイドの役割は、将来の研究で調査する必要があります。糖質コルチコイドはストレス応答性ホルモンであるため、高ストレス、交代勤務、慢性疲労の期間中の不規則な産生は、この研究で調査した免疫機能の障害を引き起こす可能性があります。他方、ＧＲに対してより強い親和性を有する可能性がある合成糖質コルチコイドの臨床投与は、おそらく内因性糖質コルチコイドレベルの日内変化を混乱させ、それによって免疫系における糖質コルチコイドの免疫増強機能を低下させる。

STAR★メソッド

 主なリソース表

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 試薬とリソース共有の連絡先

リソースと試薬の詳細および要求は、リードコンタクトの生田浩一博士（ikuta.koichi.6c@kyoto-u.ac.jp）に送信する必要があります。

 実験モデルと主題の詳細

 マウス

B6.SJL- Ptprc ^a Pepc ^b / BoyJ（B6.CD45.1コンジェニック）、B6.Cg-Tg（Cd4-cre）1Cwi（Cd4 – cre）（Lee et al。、2001）、B6.129- Nr3c1 ^tm2Gsc（Nr3c1 ^{fl / fl}）（Tronche et al。、1999）、B6.129- Cxcr4 ^tm2Tng（Cxcr4 ^{fl / fl}）（トコヨダ他、2004年）、B6.129- Il7r ^tm2Iku（Il7r ^{fl / fl}）（谷一ほか、2013年）、B6.129- Cxcl12 ^tm2Tng（Cxcl12 -GFP）（Ara et al。、2003）、およびB6.129- Il7 ^tm1.1Iku（Il7 –GFP）（原ほか、2012年）マウスを使用した。すべてのマウスは、京都大学フロンティア生命医学研究所の感染症実験研究センターで特定病原体除去条件下で飼育されました。実験は6〜12週齢のオスとメスのマウスで行われました。感染または免疫アッセイでは、8〜14週齢のオスとメスのマウスで実験を行いました。図2D、3 I、3J、S4の実験を除いて、同性の同性の対照マウスと変異マウスの各ペアを同時に分析し、複数の同性児に由来する混合性の複数のペアからデータをプールしました。C、およびS4D。異なる同腹仔のマウスを同時に分析しました。動物の苦痛を最小限に抑えるために、すべての手順はセボフルラン麻酔下で実施されました。マウスは、湿度、温度、および光の制御された条件下（12時間の明/ 12時間の暗サイクル）でグループに収容された。食物と水は自由に摂取できた。すべてのマウスプロトコルは、京都大学フロンティア生命医学研究所の動物実験委員会によって承認されました。

 GREミュータントマウスの生成

ターゲティングベクターを構築するために、以下のDNAフラグメントをベクターpBluescript KS（+）にアセンブルしました：ジフテリア毒素Aカセット、IL-7Rα遺伝子座の5’CNS1エレメントの1,822 bpフラグメント、ネオマイシン耐性遺伝子カセットに隣接lox P配列、及び変異CNS1素子および3 ‘CNS1領域を含む8521-bp断片。CNS1エレメントのinvitro突然変異誘発は、QuikChange部位特異的突然変異誘発キット（Agilent Technologies）を使用して実施しました。GRE1およびGRE2の変異は次のとおりであり、変異したヌクレオチドには下線が引かれています。GRE1野生型、5′-CTTTGTTCTTTTACATCTTCA-3 ‘。GRE1m、5’-CTT CAC T GC TTT GAG T GCTCA-3 ‘; GRE2野生型、5’-TAGCACATGCTGTACC-3 ‘; およびGRE2m、5’-TAGC GAG TGCTGTACC-3 ‘。線形化されたベクターは、エレクトロポレーションによってKY1.1 ES細胞（C57BL / 6×129S6 / SvEvTac F1バックグラウンド）に導入され、相同組換え体はPCRによってスクリーニングされました。標的ESクローンは、5 ‘および3’プローブを用いたサザンブロット分析によって確認されました（図S2 A–S2C）。ネオマイシン耐性遺伝子カセットは、Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスAdV-Cre（東京大学医科学研究所の齋藤いずむ博士からの親切な贈り物）をinvitroで標的ESクローンに感染させることにより組換え対立遺伝子から除去された。得られたESクローンにはloxのコピーが1つ含まれていました変異したCNS1エレメントの5 ‘側のP部位。ESクローンをICR8細胞胚に注入しました。キメラマウスをC57BL / 6マウスと交配し、GRE変異マウスを9世代にわたってC57BL / 6バックグラウンドに戻し交配しました。

 細菌感染

OVA（rLM-OVA）を発現する組換えリステリア菌は以前に記載されています（阿部ほか、2015年、 教皇ら、2001年、 矢島ほか、2005年）。マウスは、2.5×10を静脈内注射した⁴ ZT4又はZT16でCFU RLM-OVA。7日（168時間）後、脾臓細胞を抗体で染色した。細胞をPBS中の0.1％パラホルムアルデヒドで4℃で20分間固定した後、フローサイトメトリーを実施した。

 メソッドの詳細

 細胞の準備

灌流後、肺をはさみで細かく切り刻み、10％FBS、1 mg / mlコラゲナーゼD、および50μg/ mlDNaseIを含むRPMI-1640培地で37℃で1時間インキュベートしました。消化した肺断片を40に通しました。 -μmストレーナー。30％パーコールによる遠心分離により白血球を分離した。赤血球を溶解した後、細胞をフローサイトメトリーで分析しました。

 抗体とフローサイトメトリー

細胞は示された器官から調製され、0.05％NaN ₃および0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS中で4℃で20分間抗体で染色されました。次のタンパク質に対する蛍光色素またはビオチン結合抗体は、BD Bioscience、eBioscience、BioLegend、Invitrogen、またはTONBO Biosciencesから購入しました：CD3ε（145-2C11）、TCRβ（H57-597）、CD4（RM4.5）、CD8α （53-6.7）、CD11a（M17 / 4）、CD25（7D4）、CD44（IM7）、NK1.1（PK136）、CD69（H1.2F3）、PD-1（29F.1A12）、CXCR4（L276F12） 、CXCR5（L138D7）、CCR7（4B12）、CD62L（MEL-14）、CD95（Jo2）、GL7抗原（GL7）CD45R / B220（RA3-6B2）、CD19（6D5）、IgG1（RMG1-1）、IFN -γ（XMG1.2）、IL-2（JES6-5H4）、IL-4（11B11）、IL-13（eBio 13A）、E4BP4（S2M-E19）、GATA3（16E10A23）、CD45.2（104） 、CD122（TM-beta1）、CD127（A7R34）、リン酸化STAT5（47）、およびBcl-2（A19-3）。H-2K^b OVA G4テトラマー-SIIGFEKL-PEは、Medical and BiologicalLaboratoriesから購入しました。ビオチン化モノクローナル抗体は、PEまたはBrilliant Violet 421結合ストレプトアビジン（eBioscience）で検出されました。FlowJoソフトウェアを使用して、FACSCanto IIフローサイトメーター（BDBiosciences）で生細胞を分析しました。図では、象限、ゲート領域、および間隔ゲートの値は、各母集団のパーセンテージを示しています。Bcl-2、GATA3、およびE4BP4の細胞内染色では、Foxp3染色バッファーセット（eBioscience）を使用して、T細胞の表面抗原を染色し、固定、透過処理、および関連する抗体で染色しました。サイトカイン産生の細胞内染色では、培養CD4 ⁺ T細胞を固定し、透過処理し、IC Fixation Buffer（eBioscience）を使用して関連する抗体で染色しました。リン酸化STAT5の細胞内染色では、細胞を固定し、氷冷メタノールで透過処理し、Foxp3染色バッファーセットを使用して抗リン酸化STAT5抗体で染色しました。

 細胞の分離

ナイーブCD4 ⁺およびCD8T ⁺細胞は、EasySepナイーブCD4およびCD8 T細胞濃縮キット（STEMCELL Technologies）を使用してリンパ節から精製しました。qPCR分析の場合、CD4 ⁺ T（CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ^– NK1.1 ^–）、CD8 ⁺ T（CD3 ⁺ CD8 ⁺）、Treg（CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺）、およびTh2メモリー（CD4 ⁺ CD45.2 ⁺）FACSAria IIセルソーター（BDBiosciences）を用いて胸腺および脾臓から細胞を選別した。免疫組織化学では、Pan T Cell Isolation Kit（Miltenyi Biotech）を使用してT細胞を精製しました。末梢血中の白血球密度をCelltacαMEK6450全自動血球カウンター（日本光電工業）で測定した。

 細胞培養

精製されたT細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）、50μM2-メルカプトエタノール、および10 mM HEPES（pH 7.4）を含むRPMI1640培地で培養されました。IL-7Rαの発現を確認するために、細胞を10 ^-8 Mデキサメタゾン（Sigma）で12時間培養しました。CFSE希釈アッセイでは、ナイーブCD4 ⁺およびCD8 ⁺ T細胞をPBS中の2μMCFSE（Dojindo Laboratories）で37°Cで10分間標識しました。細胞は、4μg/ mlのプレート結合抗CD3抗体、4μg/ mlの可溶性抗CD28抗体（PV-1、東京理科大学の阿部博士からの親切な贈り物）、および20ng /で培養されました。 mlヒトIL-2（BioLegend）。96時間後、細胞をフローサイトメトリーで分析しました。以下のためのin vitro生存アッセイ、ナイーブCD4 ⁺及びCD8 ⁺ T細胞を5ng / ml IL-7（BioLegend）で培養し、ヨウ化プロピジウム陰性（すなわち生）細胞の割合を、示された時点でフローサイトメトリーによって測定しました。

 リアルタイムPCR

全RNAを単離し、ランダムプライマーを使用して逆転写しました。cDNAは、ABI7500リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）でSYBR Green PCR Master Mix（QIAGEN）を使用したリアルタイムRT-PCRによって分析されました。PCRの結果は、野生型マウスのリンパ節細胞からのcDNAのGapdhmRNAの対応するレベルに対して正規化されました。以下のプライマーを使用した：Gapdh、5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3 ‘および5’-TCTCCACTTTGCCACTGCAA-3’。Il7r、5′-GGATGGAGACCTAGAAGATG-3 ‘および5′-GAGTTAGGCATTTCACTCGT-3’; Cxcr4、5′ -TGTTGCCATGGAACCGATCA-3 ‘および5′-TGGTGGGCAGGAAGATCCTA-3’; BCL2、5′-TCGCTACCGTCGTGACTTC-3 ‘および5′-AAACAGAGGTCGCATGCTG-3’; Bclxl、5′-GGAGAGCGTTCAGTGATC-3 ‘および5′-CAATGGTGGCTGAAGAGA-3’;Il4、5′ -AGGAGCCATATCCACGGATG-3 ‘および5′-ACAGACGAGCTCACTCTCTG-3’; Il13、5′ -CAGCTCCCTGGTTCTCTCAC-3 ‘および5’-ACACTCCATACCATGCTGCC-3’。

 クロマチン免疫沈降アッセイ（ChIP）

ChIPは前述のように実行されました（Lee et al。、2005）。簡単に説明すると、5× 106^個のナイーブCD4 ⁺ T細胞を1％ホルムアルデヒドで、室温で5分間固定しました。可溶性クロマチンを5μgの抗GR抗体（BuGR-2、Merck）またはマウスIgG（Jackson ImmunoResearch）で一晩免疫沈降させました。精製されたChIPと入力DNAはリアルタイムPCRによって測定されました。CNS-1領域を検出するために使用されたPCRプライマーはCNS-1 / F、5′-CCATTGCTCACCCACAATCTC-3 ‘でした。CNS-1 / R、5’-GCTATCACTCCATGGTGAAC-3 ‘。

 トランスウェル遊走アッセイ

ナイーブCD4 ⁺ T細胞を無血清培地（1％BSA、10 mM HEPES [pH7.4]を含むRPMI1640）に懸濁しました。移動アッセイは、孔径5μmのポリカーボネートメンブレンを備えたトランスウェルチャンバーで実施しました（Corning）。100 ng / mlのCXCL12（TONBO）を含む培地を下部チャンバーに加え、メンブレンを上部に配置しました。T細胞（1×10 ⁵）を上部チャンバーにロードし、37℃で2時間培養しました。下部チャンバー内の細胞を収集し、フローサイトメトリーで分析しました。

 インビボホーミングアッセイ

マウスは、ナイーブCD4 ZT4又はZT16で屠殺し、そして精製した⁺制御CD45.1からT細胞を⁺（C57BL / 6）及びCD45.2 ⁺（Nr3c1 ^{FL / FL} CD4 -cre ⁺又はIL7R ^{CNS1.GRE12m / 12メートル}）マウスを1：1の比率で混合し、CFSEで標識し、CD45.2 ⁺ C57BL / 6マウス（合計5×10 ⁶）にそれぞれZT6またはZT18で移しました。ドナー細胞の正確な移入前のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって残りのドナー細胞を分析することによって決定された。CFSE ⁺ドナー細胞は、脾臓、リンパ節、および末梢血で1時間後に分析されました。CD45.1 ⁺からのドナー細胞のパーセンテージ示された組織の総CFSE ⁺ドナー細胞における対照マウスおよびCD45.2 ⁺変異体（Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺またはIl7rCNS1.GRE12m ^{/ 12 m}）マウスは、ドナー細胞の移植前パーセンテージによって正規化された。

 免疫組織化学

マウスをZT16で犠牲にし、リンパ節から精製したT細胞をCMTMR（Setareh Biotech）またはCellTracker Deep Red（Thermo Fisher Scientific）で標識し、ZT18でCxcl12 -GFPおよびIl7 -GFPマウスに移しました。１時間後、レシピエントマウスの脾臓を４％パラホルムアルデヒドで６時間固定した。組織切片は、以前に記載されたように調製および分析された（Cui et al。、2014）。ブロッキング後、サンプルを抗TCRβ（H57-597）、抗B220（RA3-6B2）、抗CD31（MEC13.3）、抗ウサギIgG（Poly4064）、抗GFPウサギポリクローナル抗体、およびstreptavidin–Brilliant Violet 421を使用して、T細胞ゾーン、B細胞ゾーン、およびIL-7シグナルを検出し、PermaFluor封入剤（Shandon）で封入します。共焦点イメージングは​​、TSC-SP8顕微鏡（LeicaMicrosystems）で実施しました。

 デキサメタゾン投与

デキサメタゾン21-リン酸二ナトリウム塩（200μg）（Sigma）またはPBSをZT0で腹腔内注射した。4時間後（ZT4）、マウスを犠牲にしました。

 カスパーゼアッセイ

ナイーブCD4 ⁺ T細胞をZT4またはZT16で精製し、IL-7を含まない培地で3時間培養しました。活性カスパーゼ-3の発現は、CaspGLOWフルオレセイン活性カスパーゼ-3染色キット（Thermo Fisher Scientific）を使用してフローサイトメトリーで検出されました。

 免疫

ZT16でミョウバン（Thermo Scientific）に乳化した100μgのOVA（グレードV、Sigma Aldrich）を腹腔内注射することにより、マウスを免疫しました。脾細胞を7日後に単離し、100μg/ mlOVAで72時間刺激した。刺激後、培養上清中のサイトカインをELISA（eBioscience）で測定した。Tfh細胞（TCRβ ⁺ CD4 ⁺ CD44 ⁺ CXCR5 ⁺ PD-1 ⁺）をソートし、それらのmRNAを精製しました。胚中心B細胞を分析するために、ZT4またはZT16のミョウバンに乳化した100μgのOVAを腹腔内注射してマウスを免疫しました。12日後、脾臓細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析しました。抗体産生のために、ZT16でミョウバンに乳化された100μgのNP-OVA（LGC Biosearch Technologies）を腹腔内注射することによりマウスを免疫した。20日後、血清を収集し、以前に記載されたようにELISAによって分析した（秦ほか、2016年）。

 Thサブセットの誘導

ZT4およびZT16で単離されたナイーブCD4 ⁺ T細胞は、IL-12の存在下で4μg/ mlプレート結合抗CD3、4μg / ml可溶性抗CD28、および20 ng / ml hIL-2とともに培養されました（10 Th1分化にはng / ml）と抗IL-4抗体（5 ng / ml）、Th2分化にはIL-4（10 ng / ml）と抗IFN-γ抗体（5 ng / ml）。7日後、細胞をPMA（50 ng / ml）およびイオノマイシン（2μg/ ml）でブレフェルジンAの存在下で4時間再刺激しました。再刺激後、細胞を固定し、透過処理し、指示された抗体で染色しました。サイトカイン。

 メモリーCD4 ⁺ T細胞の生成

Nr3c1 ^{fl / fl}（コントロール）、Nr3c1 ^{fl / fl} Cd4 -cre ⁺（GRcKO）、またはIl7r ^{CNS1.GRE12m / 12 m}（GRE12m）マウスから精製したナイーブCD4 ⁺ T細胞を、Th2条件下で6日間培養しました。エフェクター細胞（2.5×10 ⁷）をB6.CD45.1 ⁺マウスに移しました。4週間後、レシピエントマウスを犠牲にし、脾臓、リンパ節、および肺からのリンパ球をフローサイトメトリーで分析しました。

 定量化と統計分析

すべてのデータは平均±SEMとして表されます。2つのサンプル間の比較は、対応のない両側スチューデントのt検定を使用して実行されました。一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定および二元配置分散分析を使用して、複数のグループを比較しました。統計分析は、GraphPad Prism7ソフトウェアを使用して実行されました。^∗ p <0.05、^∗∗ p <0.01、および^∗∗∗ p <0.001。

謝辞

Drsに感謝します。KY1.1 ESラインとターゲティングシステムを提供してくれた武田、湯佐、近藤、そしてバトゥ・アーマン博士と生田研究室のメンバーが議論しました。この作品は、京都大学フロンティア生命医学研究所共同利用研究センタープログラムにより、日本学術振興会科研井助成番号16K15288、16H05172、15H01153（KI）、26460572（ST）、16K08835（TH）の支援を受けました。京都大学研究調整同盟の将来の開発資金調達プログラム、および日本学術振興会（JSPS）とTUBITAK共同研究プロジェクトによる。ASは、教育文化スポーツ省の生活システムへの動的アプローチのためのプラットフォームによってサポートされていました。科学技術（文部科学省）と日本医療研究開発機構（AMED）。GCは日本学術振興会国際研究員でした。

著者の貢献

ASは実験を設計および実行し、論文を執筆しました。GC、ST、MO、SA、FO、およびTHはいくつかの実験を行いました。SKとHMはGRE変異マウスを生成しました。HYとYYはLM-OVAを提供し、いくつかの研究を監督しました。TNはCxcr4fl ^{/ fl}およびCxcl12 -GFPマウスを提供しました。GSはNr3c1fl ^{/ fl}マウスを提供しました。KIは、研究の概念化と監督、いくつかの実験の設計と実行、データの議論、論文の執筆を行いました。

利害関係の宣言

著者は、宣言するための競合する利害関係はありません。

補足情報

• .pdfをダウンロード（2.23 MB）PDFファイルのヘルプドキュメントS1。図S1〜S7

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記事情報

出版履歴

公開日：2018年1月23日承認済み：2017年12月29日改訂版で受領：2017年9月5日受領日：2017年3月2日

識別

DOI：https：//doi.org/10.1016/j.immuni.2018.01.004

著作権

©2018Elsevier Inc.

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数字

• グラフィカルな抽象
• 図1GRはIL-7Rの発現とT細胞の分布を日中制御する
• 図2GRによるIL-7R誘導は、T細胞分布の日変化を調節します
• 図3GRによるIL-7R誘導は、CXCR4発現を調節することによりT細胞分布の日変化を制御します
• 図4GRによるCXCR4発現のアップレギュレーションはCXCL12産生細胞へのT細胞遊走を誘導する
• 図5GRはT細胞のクローン増殖と免疫応答の日変化を調節する
• 図6GRはTh細胞サブセットの分化と体液性免疫反応を制御します
• 図7GRは、IL-7R発現を誘導することにより、メモリーCD4 ⁺ T細胞の維持をサポートします

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